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女性的高雄激素状态:目前实验室对于女性高雄激素状态诊断存在的缺陷

2018-09-27 14:28 来源: 中国妇产科网 作者: 中国妇产科网 浏览量: 2151

        测量总睾酮水平是评估女性雄激素过量的一线方法。实验室测量睾酮水平的主要缺陷是由睾酮的低浓度以及循环中的雄激素和睾酮之间的结构相似性引起的,为了减少这些缺陷,要求测量技术具有高度的特异性和敏感性。这些目标可以通过使用一种特殊的抗睾酮单克隆抗体来实现,且最好是在提纯之后使用。液相色谱-串联质谱联用(LC-MS /MS)今后将会常用于测定睾酮水平,此方法可以实现低检测限度和理想的准确度。然而,这两种技术的缺陷也是很明显的,我们必须认识到并系统地加以解决。一般来说,使用睾酮免疫分析法和质谱法的实验室需要在质量框架内运作,并积极开展外部质量控制流程和标准化,以确保可以适当的解释不同实验室之间的差异。循环中的睾酮与性激素结合球蛋白(SHBG)紧密结合,而SHBG水平在超重的高雄激素患者中是典型的低水平。因此,低SHBG水平可能导致循环睾酮检测为正常值,这将掩盖患者雄激素过量的真实状态。人们期待的可以直接检测游离睾酮的方法尚未被开发出来,避免这种缺陷的方法就是测量SHBG并计算游离睾酮水平。本综述还将讨论其他一些缺陷,包括对肾上腺源雄性激素检测的探索,目的是帮助临床医生更好的开展对雄激素过量女性的实验室检测。

          高雄激素状态是女性过度型雄激素紊乱的主要临床表现。他们包括可以引起雄性激素生成过多的特殊雄激素分泌型的肿瘤,影响肾上腺类固醇激素生成的罕见的遗传性疾病,以及非常常见的多囊卵巢综合征(PCOS)(1、2、3、4、5、6)。高雄激素状态还包括外周血雄激素代谢产物增加以及雄性激素的细胞有效性和生物活性增加(7、8)。最后,他们还可能涉及到由于细胞内代谢活跃和雄激素受体引起的细胞内雄激素活性增加(9)。高雄激素状态是非常普遍的,全球范围内的总体患病率为6-12%(10,11),这就提出了如何进行实验室检测来指导临床诊断的问题(12,13,14)。一些典素过剩或缺乏可以激活或抑制内分泌维持稳态的调节系统功能,导致腺体分泌活动增强或减低 (15)。由于这种强有力的反馈调节方式,通过测量甲状腺、肾上腺型的临床表现可以提示内分泌系统疾病,包括过度或不足的激素分泌量和活性。特定来源的激素以及相关调节它们的垂体因子可以确定大多数内分泌失调。检测标本包括血液、唾液或尿液样本,甚至可以检测细胞中的激素。然而,尽管这种反馈调节方式非常适合实验室对甲状腺功能的测定、平衡甲状腺激素(T4/T3)和甲状腺刺激激素(TSH)的数据,但在女性雄激素紊乱方面却不是同样适用的:激素水平随月经周期天数变化、雌二醇升高对黄体生成素的正反馈作用而非负反馈作用、高雄激素对黄体生成素抑制孕酮升高的抑制性调控一直困惑着临床工作者。

        这篇综述中将挑战传统上的通过检测雄激素可以准确识别女性高雄激素状态来源概念,通过辨别检测缺陷和如何规避缺陷,从而获得准确的诊断。

对高雄激素状态的诊断方法的一致意见和建议

        女性高雄激素状态有毛发过度增生(多毛症),同时有脂溢性皮炎导致的复发性痤疮或雄激素性脱发。而发病迅速的男性化症状,比如声音男性化,异常的肌肉增生和阴蒂增大等提示的罕见雄激素分泌型肿瘤,必须及时鉴别诊断(5,9)。

        从1990年美国国立卫生院举办的PCOS专项的会议(2,4)、欧洲人类生殖与胚胎协会和美国生殖医学会联合举办的鹿特丹PCOS共识研讨会组(3)、高雄激素和PCOS协会(4)、法国内分泌学会共识(13)和欧洲内分泌学会的PCOS特殊兴趣小组(18)等大多数专家共识建议高雄激素状态应首先检测总睾酮水平 (图1)。

 

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图1鉴别女性中雄性激素过量类型的范例

 

        睾酮究竟是不是识别高雄激素状态最相关的激素呢?睾酮在血液中循环,与白蛋白松散结合,但与性激素结合球蛋白(SHBG)特异性紧密结合。根据质量作用定律,一个小的类固醇片段可以不与蛋白质结合而直接作用于靶细胞,而在女性中,这一比例不到2%,而白蛋白结合复合物的比例为41%,性激素结合球蛋白复合物比例为57%(19)。

        尽管已经有研究表明性激素结合球蛋白与主要的内吞受体相互作用,为细胞摄取有生物活性的雄激素和雌激素提供了特定的途径(20)。这种途径已在滋养细胞系中被报道,可能是妊娠后雄激素被转运到胎盘进行芳香化的重要途径。此外,在人类乳腺癌和前列腺癌细胞中也发现了人性激素结合球蛋白 (21),其通过与基质相关蛋白-腓骨蛋白之间的相互作用,也可以从血液中游离到子宫内膜的基质中(22)。综上所述,这些有趣的发现挑战了游离荷尔蒙假说。

        测量睾酮的基本原理是基于睾酮循环中主要有生物活性的雄性激素的假设。睾酮在公众、学生和医生中都有很强的“媒体形象”。膜细胞来源的雄烯二酮和肾上腺皮质来源的脱氢表雄酮(DHEA)均是雄激素生成的主要前体物质,它们可以被转化为睾酮,尤其是在脂肪组织中(23)。

        循环中睾酮的浓度依赖于睾酮的产生速率(PR),包括卵巢的直接分泌以及卵巢和肾上腺前体细胞的外周代谢。相反的,代谢清除率(MCR),也就是指单位时间不可逆地清除的循环血量是降低循环中雄激素浓度的主要过程。性激素结合球蛋白与双氢睾酮、睾酮和雌二醇的紧密结合力(呈数量级下降(19))与各自的代谢清除率成反比,分别为315、485和720 L/天(23,24,25,26)。相比之下,脱氢表雄酮和雄烯二酮表现出低的亲和力,与性激素结合球蛋白结合较弱,所以它们的代谢清除率较高,分别为2200和1200 L/天(表1)。

表1 半衰期(T1/2),代谢清除率(MCR)和依据Longcope等(23, 24)、Mahoudeau等(25) 和Dunn 等(19)测定的在37°C环境下的蛋白结合亲合力常数

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通过直接免疫分析法检测总睾酮水平缺陷

        总睾酮水平与女性多毛症的严重程度关系不大,这一点已经通过睾酮参照分析方法被记录下来(27)。严重多毛症患者的睾酮水平可能是正常的,其原因可能是高雄性激素敏感性或睾酮清除率的增加。与此相反,鹿特丹共识(3)指出,患者超声检查显示卵巢存在多囊样改变可能存在睾酮水平升高,同时并没有毛发异常增生和复发性痤疮的体征。

        月经周期中睾酮水平的变化是非常不明显的。虽然建议早期卵泡期测量睾酮水平,但在禁食条件下任何时间或周期阶段的的血液标本对测量睾酮都是有效的。

睾酮的低浓度以及循环中雄性激素和睾酮之间的结构相似性均要求更高精确度和敏感性的技术来测定睾酮水平(28)。这些要求可以通过竞争免疫分析方法来实现,这依赖于抗体与小分子结合的固有能力。为了测定睾酮,抗体是根据其特殊结构来设计的,但同时以其特异性为代价,因为睾酮的结构与其他循环中的雄性激素相似。类固醇由于与睾酮的结构相似性和/或类固醇缺乏抗体特异性从而干扰检测结果,而预先使用有机溶剂进行提取,然后用色谱分析法对提取物进行纯化处理,可以消除干扰免疫反应的类固醇(12,13,13)。类固醇的提取也消除了许多基质效应,主要与类固醇转运蛋白(白蛋白和性激素结合球蛋白)有关。

        精确度和特异性主要取决于捕获睾酮的抗体的质量和显示睾酮-抗体结合复合物的技术。

        免疫分析法的检测低限或灵敏度部分取决于标记的探针和用来固定免疫复合物的系统,主要的标记物有放射性元素(碘125和氚)、酶(辣根过氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶)、荧光(铕)和化学发光。用铕进行并使用时间分辨的类固醇免疫分析法(时间分辨荧光免疫分析技术)通常比氚标记的或酶-偶联示踪剂具有更高的敏感性,并且挑战了使用碘125标记类固醇的免疫分析法,因为这种方法无放射性且稳定(29)。

        此外,免疫分析法还利用高亲和性的链酶亲和素-生物素系统,将小生物素分子与待测的酶或激素结合。利用链酶亲和素对生物素和其化合物的高结合亲和力(Ka = 1015),在固相基质中固定免疫复合物。这种方法大大提高了免疫分析法的精确度。目前,化学发光和荧光是现代自动分析仪的主要检测原理,而放射性系统应用较少。表2列出了直接免疫分析法测定睾酮的主要优点、缺点和缺陷。

与检测激素的免疫分析法进步相关的新缺陷

        使用链酶亲和素-生物素系统的激素免疫分析法可能会受到循环中高浓度的生物素的影响,从而导致误诊的风险。在长期以来的甲状腺疾病诊断中,这种误诊的风险已被公认(30,31,32,33)。生物素(维生素B7)是一种水溶性维生素,每日推荐摄入量为毫克计。高剂量的生物素(每日推荐摄入量的10000倍)目前被认为可以改善多发性硬化患者的临床结局和生活质量。

        根据所使用的系统,血液样本中过量的生物素通过与生物素化激素或生物素化特异性抗体的竞争,将与固相的链酶亲和素覆盖的微粒结合从而干扰信号系统,导致检测值高估或低估。为了避免这一缺陷,我们已经证明,当在检测试剂盒中添加磁性链酶亲和素覆盖的微粒时,可以有效吸附生物素,从而消除生物素的干扰(34)。包括在脱发和糖尿病在内的各种疾病的治疗中,使用生物素被认为可能使患者获益,因此患者有时可能会使用生物素作为补充药物。已有报道称在这些情况下,睾酮和脱氢表雄酮的检测结果出现虚假的高值(33),但这仍有待进一步的证实。

用质谱分析法测量睾酮

    本章涉及非常广泛的有关质谱法原理、成分和软件的信息,也鼓励读者多交流。气相色谱分析(GC)结合质谱分析(MS)是用于简单分子质量的选择性检测的原始性分析手段,也是测定睾酮(35,36)的一种参考方法。气相色谱-质谱分析需要一个大的血液样本量(>2ml)来进行萃取和衍生化。液相色谱分析法(LC)的发展以及大气压化学电离和电喷雾电离方式的出现,使得气相色谱分析可以直接与液相色谱-质谱耦合。因为睾酮结构中包含不饱和的羰基,这些羰基在没有衍生化时非常容易被电离。而由于洗脱相为液相,气相色谱分析-质谱分析法显著的进步是检测类固醇包括睾酮时没有必要再进行衍生化。

        通过耦合2个四极杆离子过滤器和一个穿插的碰撞池,可以揭示目标类固醇的裂解模式,串联质谱分析的引入大大增加了液相色谱-质谱联用法的敏感性。目前,液相色谱-质谱联用/质谱分析技术提供了最好的类固醇测定质量。这种方法极大地改进了目前对先天性类固醇代谢紊乱的研究和理解,包括21-羟化酶缺乏症(37)。

        因为所需设备的成本高、非常专业的技术以及过程耗时长等,使得这项技术的推广存在一系列难度,目前液相色谱-质谱联用/质谱分析技术在欧洲并没有广泛用于实验室。或许在不久的将来,当自动化分析平台成功建立后,分析成本降低,液相色谱-质谱联用/质谱分析技术可以在日常应用并可以替代免疫分析法。超高效液相色谱法(UPLC)目前正在提高分析速度、灵敏度和分辨率(38)。LC-MS /MS的精确度为评估妇女和儿童的雄激素状态提供了参考(28,36)。

用质谱分析法测量睾酮的缺陷

        LC-MS /MS的应用能精确的测量总睾酮的水平。然而,必须认识到这种检测方法的缺陷并系统地加以解决(38,39)。MS/MS检测的选择性最初被高估了。LC-MS /MS方法的误差产生可能与目标分析物和内部标准化合物的电离过程和基质效应有关。大多数潜在的测量误差来源都可以通过质谱分析前充分利用液相色谱分离的样本来控制。

        最后,不可靠结果的重要来源包括人为错误,而自动化的临床化学分析仪可能将这种风险降到最低。目前只有少数商用的LC-MS /MS检测试剂盒可用,而且它们的仪器配置仍然是非常多样化的。以开发出完全自动化为最终目标,使LC-MS /MS过程自动化,这不仅是在临床实验室更广泛地使用这一强大技术的先决条件,而且也是提高检测结果可靠性的必要条件。LC-MS /MS测量睾酮的主要优点和缺点见表3。

表3 LC-MS /MS检测睾酮的主要优点与缺点及缺陷。


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翻译:周瑶

单位:广州市南方医院

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